Метод визначання масової концентрації органічних кислот

НАЦІОНАЛЬНИЙ СТАНДАРТ УКРАЇНИ

ВИНА І ВИНОМАТЕРІАЛИ

Метод визначання масової

Концентрації органічних кислот

Методом високоефективної рідинної

Хроматографії

ДСТУ ХХХХ:ХХХХ

Видання офіційне

Київ

ДЕРЖСПОЖИВСТАНДАРТ УКРАЇНИ

200_
ПЕРЕДМОВА

1 РОЗРОБЛЕНО: Національний інститут винограду і вина “Магарач” і ТК 23 “Продукція садів, виноградників і виноробна продукція”

РОЗРОБНИКИ: А. Авідзба, д-р с.-г. наук; Н. Анікіна, канд. техн. наук; В. Бєляєв; В. Гержикова, д-р техн. наук (керівник розробки); І. Гусєва; О. Дерновá; В. Загоруйко, д-р техн. наук; Н. Кравченко; Є. Сластя, канд. біол. наук

2 ПРИЙНЯТО ТА НАДАНО ЧИННОСТІ: наказ Держспоживстандарту України від “____”_________________ № ____

ЗМІСТ

1 Сфера застосування……………………………………....……...……….. 1

2 Нормативні посилання………………………………….......…………….. 1

3 Терміни та визначення понять…………………………….......………… 2

4 Відбирання і підготовка проб…………………………….….......…..…… 3

5 Метод визначання....……………………………………………......…...… 3

6 Контроль якості результатів визначання.....….........................……… 8

7 Вимоги безпеки…………………………………………………...…..…....... 9

Додаток А Умови проведення аналізу.............……................................ 10

Додаток Б Приклади хроматограм ........................................................... 11

Додаток В Бібліографія ………………..…….........................………......... 12

НАЦІОНАЛЬНИЙ СТАНДАРТ УКРАЇНИ

ВИНА І ВИНОМАТЕРІАЛИ

Метод визначання масової концентрації органічних кислот методом високоефективної рідинної хроматографії

ВИНА И ВИНОМАТЕРИАЛЫ

Метод определения массовой концентрации органических кислот

Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Wines and wine materials. Method to determine mass-concentrations of organic acids by high performance liquid chromatography

Чинний від ______________

1 СФЕРА ЗАСТОСУВАННЯ

Цей стандарт установлює метод визначання масової концентрації органічних кислот у винах та виноматеріалах із застосуванням високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ). Метод базується на розділенні компонентів проби в ізократичному режимі хроматографічною колонкою, що наповнена оберненофазовим сорбентом. Це дає змогу одночасно визначити вміст винної, лимонної, молочної, яблучної та янтарної кислот у діапазоні масових концентрацій від 50 мг/дм3 до 10 000 мг/дм3.

2 НОРМАТИВНІ ПОСИЛАННЯ

У цьому стандарті є посилання на такі нормативні документи:

ДСТУ ГОСТ 908:2006 Кислота лимонна моногідрат харчова. Технічні умови

ДСТУ 2163–93 Виноробство. Терміни та визначення

ДСТУ 4621:2006 Кислота молочна харчова. Загальні технічні умови ____________________________________________________________

Видання офіційне

ГОСТ 12.1.019–79 ССБТ. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты (Електробезпечність. Загальні вимоги і номенклатура видів захисту)

ГОСТ 12.3.002–75 ССБТ. Процессы производственные. Общие требования безопасности (Процеси виробничі. Загальні вимоги безпеки)

ГОСТ 1770–74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия (Посуд мірний лабораторний скляний. Циліндри, мензурки, колби, пробірки. Загальні технічні умови)

ГОСТ 6341–75 Кислота янтарная. Технические условия (Кислота янтарна. Технічні умови)

ГОСТ 6709–72 Вода дистиллированная. Технические условия (Вода дистильована. Технічні умови)

ГОСТ 14137–74 Вина, виноматериалы, коньяки и коньячные спирты. Правила приемки и методы отбора проб (Вина, виноматеріали, коньяки та коньячні спирти. Правила приймання та методи відбирання проб)

ГОСТ 21205–83 Кислота винная пищевая. Технические условия (Кислота винна харчова. Технічні умови)

ГОСТ 24104–88 Весы аналитические первого класса точности. Общие технические условия (Ваги аналітичні першого класу точності. Загальні технічні умови)

ГОСТ 25336–82 Посуда и оборудование лабораторное. Типы, основные параметры и размеры (Посуд та обладнання лабораторне. Типи, основні параметри і розміри)

ГОСТ 28498–90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний (Термометри рідинні скляні. Загальні технічні вимоги. Методи випробування)

ГОСТ 29227–91 (ИСО 835-1–85) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования (Посуд лабораторний скляний. Піпетки градуйовані. Частина 1. Загальні вимоги).

3 ТЕРМІНИ ТА ВИЗНАЧЕННЯ ПОНЯТЬ

У цьому стандарті використано терміни та визначення понять згідно з ДСТУ 2163.

4 ВІДБИРАННЯ І ПІДГОТОВКА ПРОБ

4.1 Відбирання проб здійснюють згідно з ГОСТ 14137.

4.2 Проби виноматеріалів і вин, насичених діоксидом вуглецю, дегазують в ультразвуковій бані і фільтрують через фільтр-патрон з розміром пір 0,45 мкм.

4.3 Проби фільтрують через мембранний фільтр-патрон з розміром пір 0,45 мкм.

5 МЕТОД ВИЗНАЧАННЯ

5.1 Суть методу

Метод визначання масової концентрації органічних кислот заснований на принципах оберненофазової ВЕРХ. Проба, що містить органічні кислоти, за допомогою дозуючого пристрою подається в хроматографічну колонку, де піддається розділенню на прищепленій фазі сорбенту в ізократичному режимі подачі елюенту. Компоненти проби в процесі послідовного елюювання з хроматографічної колонки поступають в проточну кювету спектрофотометричного детектора, де реєструються за зміною оптичної густини. Ідентифікацію піків органічних кислот здійснюють методом добавки стандартних зразків кислот. Масову концентрацію органічних кислот розраховують за допомогою коефіцієнта лінійної залежності, що розраховується із значень площ піків кислот градуювальних розчинів.

5.2 Апаратура, засоби вимірювання, посуд, матеріали:

―  Баня ультразвукова для миття посуду згідно з чинним нормативним документом;

―  Колонка хроматографічна, заповнена сорбентом на основі силікагелю з прищепленою октадецилсиланольною фазою, з ефективністю не менше ніж 5 000 теоретичних тарілок згідно з чинним нормативним документом;

―  Хроматограф рідинний, укомплектований проточним дегазатором, 4-х канальним насосом градієнта низького тиску, пристроєм введення проби і діодно-матричним або спектрофотометричним детектором згідно з чинним нормативним документом;

―  Ваги аналітичні 2-го класу точності згідно з ГОСТ 24104;

―  Термометр ТЛ-21–А2 або ТЛ–21–Б2 до 100 ºС Із ціною поділки не більше ніж 1 ºС згідно з ГОСТ 28498;

―  Колби мірні 1-50-2, 1-100-2 і 1-1000-2 Згідно з ГОСТ 1770;

―  Піпетки мірні 1-1-2-1, 1-5-2-1 і 1-10-2-1 згідно з ГОСТ 29227;

―  Стакани для зважування СВ–24/10 або СН–34/12 згідно з ГОСТ 25336;

―  Шприц медичний місткістю 5 см3 згідно з чинним нормативним документом;

―  Вода Дистильована згідно з ГОСТ 6709;

―  Кислота винна згідно з ГОСТ 21205;

―  Кислота лимонна згідно з ДСТУ ГОСТ 908;

―  Кислота молочна згідно з ДСТУ 4621;

―  Кислота трифтороцтова, особливо чиста, згідно з чинним нормативним документом;

―  Кислота яблучна згідно з чинним нормативним документом;

―  Кислота янтарна згідно з ГОСТ 6341;

―  Метанол для ВЕРХ згідно з ТУ 6–09–1709 [1];

―  Фільтр-патрони мембранні з нейлону з розміром пір 0,45 мкм згідно з чинним нормативним документом.

Дозволено використовувати іншу апаратуру, засоби вимірювальної техніки, посуд та матеріали, вітчизняні чи імпортні, з характеристиками, не гіршими за вказані.

5.3 Підготовка до проведення вимірювання

5.3.1 Підготовка пересувної фази

5.3.1.1 Підготовка елюенту «А» (0,02 % розчин трифтороцтової кислоти)

Відважують 1 г трифтороцтової кислоти в мірну колбу місткістю 50 см3, об'єм доводять бідистильованою водою до мітки. Відбирають аліквоту 10 см3 приготованого розчину, поміщають в мірну колбу місткістю 1 000 см3, об'єм доводять бідистильованою водою до мітки. Елюент «А» фільтрують через фільтр з розміром пір 0,45 мкм.

5.3.1.2 Підготовка елюенту «В»

Елюентом «В» є метанол кваліфікації для ВЕРХ. Елюент «В» фільтрують через фільтр з розміром пір 0,45 мкм.

5.3.2 Підготовка хроматографа до виконання вимірювання

Підготовка хроматографа до виконання вимірювання проводиться згідно з керівництвом по експлуатації хроматографа.

Підготовка хроматографічної колонки до виконання вимірювання проводиться шляхом послідовного пропускання елюенту «В» в кількості не менше ніж п'ять об'ємів колонки і елюенту «А» до повної стабілізації «нульової» лінії детектора при детектуванні на довжині хвилі 210 нм.

5.3.3 Підготовка градуювальних розчинів

5.3.3.1 Приготування градуювального розчину органічних кислот з масовою концентрацією 5 000 мг/дм3

На аналітичних вагах відважують по (500 ± 0,2) мг винної, лимонної, молочної, яблучної і янтарної кислот та переносять в мірну колбу місткістю 100 см3 і доводять до мітки дистильованою водою.

5.3.3.2 Приготування градуювального розчину органічних кислот з масовою концентрацією 2 500 мг/дм3

Аліквоту 50 см3 розчину органічних кислот з масовою концентрацією 5 000 мг/дм3 поміщають в мірну колбу місткістю 100 см3 і доводять до мітки дистильованою водою.

5.3.3.3 Приготування градуювального розчину органічних кислот з масовою концентрацією 1 000 мг/дм3

Аліквоту 20 см3 розчину органічних кислот з масовою концентрацією 5 000 мг/дм3 поміщають в мірну колбу місткістю 100 см3 і доводять до мітки дистильованою водою.

5.3.3.4 Приготування градуювального розчину органічних кислот з масовою концентрацією 500 мг/дм3

Аліквоту 10 см3 розчину органічних кислот з масовою концентрацією 5 000 мг/дм3 поміщають в мірну колбу місткістю 100 см3 і доводять до мітки дистильованою водою.

5.3.3.5 Приготування градуювального розчину органічних кислот з масовою концентрацією 50 мг/дм3

Аліквоту 1 см3 розчину органічних кислот з масовою концентрацією 5 000 мг/дм3 поміщають в мірну колбу місткістю 100 см3 і доводять до мітки дистильованою водою.

5.4 Виконання вимірювання

5.4.1 Умови проведення хроматографічного аналізу

Хроматографічний аналіз проб і градуювальних розчинів проводять в режимі ізократичного елюювання компонентів проби елюентом «А», промивку колонки проводять прокачуванням елюенту «В» в кількості не менше ніж п'ять об'ємів колонки, урівноваження колонки прокачуванням елюенту «А» до стабілізації нульової лінії. Тривалість аналізу встановлюється за часом виходу останнього компоненту градуювального розчину. Приклад умов розділення органічних кислот наведено в додатку А. Детектування піків і реєстрацію хроматограми проводять по поглинанню в короткохвильовій ультрафіолетовій області спектру при довжині хвилі 210 нм. Введення проби здійснюють відповідно до параметрів робочої місткості хроматографічної колонки з використанням петлевого інжектора або автоматичної системи введення проб. Ідентифікацію піків органічних кислот на зареєстрованій хроматограмі проводять методом добавки стандартного зразка, а також по їхніх часах утримування і спектральних характеристиках. Площу піків отримують за допомогою програмного забезпечення, призначеного для обробки хроматографічних даних.

Проводять два паралельних дослідження проби, оперативний контроль збіжності здійснюють згідно з 6.2. У разі перевищення нормативу оперативного контролю збіжності дослідження повторюють.

5.4.2 Проведення вимірювань градуювальних розчинів для розрахунку коефіцієнту лінійної залежності

Градуювальні розчини аналізують в режимі хроматографічного розділення згідно з 5.4.1. Кожен градуювальний розчин аналізують не менше ніж три рази. Отримані значення площ піків використовують для розрахунку коефіцієнта лінійної залежності програмним забезпеченням для обробки хроматографічних даних. Вимірювання градуювальних розчинів та перерахунок коефіцієнту лінійної залежності проводять при постановці методу, при заміні хроматографічної колонки та періодично після проведення 100 аналізів.

5.5 Опрацювання результатів вимірювання

Масову концентрацію кожної органічної кислоти в пробах розраховують, використовуючи значення площ піків кислот на хроматограмах, одержаних в результаті аналізу. Розрахунок концентрацій органічних кислот проводять, використовуючи коефіцієнт лінійної залежності площі піку від концентрації. Результатом вимірювання є цілочисельне значення, виражене в мг/дм3.

За остаточний результат визначання масової концентрації органічних кислот приймають середнє арифметичне значення результатів двох паралельних визначень.

Збіжність між результатами двох паралельних визначень не повинна перевищувати норматив оперативного контролю Dn=10% при довірчій ймовірності Р=0,95. Відносна погрішність методу D £ 10 % при довірчій ймовірності Р=0,95.

6 КОНТРОЛЬ ЯКОСТІ РЕЗУЛЬТАТІВ ВИЗНАЧАННЯ

6.1 Оперативний контроль збіжності проводять під час кожного випробування, порівнюючи результати двох паралельних визначань масової концентрації органічних кислот в одній й тій же пробі, що проведено відповідно до цього стандарту одним виконавцем.

6.2 Результати контролю збіжності обчислюють за формулою та вважають позитивними за таких умов:

, (1)

Де , — результати паралельних визначань масової концент-

рації органічних кислот у досліджуваній пробі, г/дм3;

— норматив контролю збіжності масової концентрації

органічних кислот у пробі, зазначеній у 5.6.

Якщо умова не виконується, визначання повторюють. У випадку повторного одержання негативного результату з'ясовують причини, які призводять до незадовільних результатів контролю, і усувають їх.

Контроль збіжності проводять при випробуванні кожної проби.

6.3 Результати випробування оформлюють у вигляді звіту про проведене випробування, який повинен містити щонайменше наступну інформацію:

―  найменування зразка;

―  дату відбирання зразків;

―  дату проведення випробування;

―  результати випробування;

―  познаку цього стандарту.

7 ВИМОГИ БЕЗПЕКИ

7.1 Загальні вимоги безпеки — згідно з ГОСТ 12.3.002.

7.2 Освітлення приміщення для проведення випробування повинно відповідати вимогам ДБН В.2.5-28 [2].

7.3 Охорону праці робітників забезпечують проведенням заходів згідно з ГОСТ 12.3.002.

7.4 Виробничі приміщення обладнують вентиляцією згідно зі СНиП 2.04.05 [3].

7.5 Мікроклімат виробничих приміщень — згідно з ДСП 3.3.6.042 [4].

7.6 Вимоги електричної безпеки — згідно з ГОСТ 12.1.019.

ДОДАТОК А

(довідковий)

УМОВИ ПРОВЕДЕННЯ АНАЛІЗУ

Метод вимірювання концентрацій органічних кислот було апробовано на хроматографі фірми Shimadzu (модель LC20 Prominence), укомплектованому проточним вакуумним дегазатором, системою подачі розчинників (насос), 4-х канальним модулем градієнта низького тиску, автоматичним інжектором і діодноматричним детектором.

Для проведення аналізу було використано хроматографічні колонки: 1) Phenomenex Luna C18 (2) розміром 2,1 х 150 мм, заповнена сорбентом із прищепленою октадецильною фазою (подвійний ендкемпінг) зернінням 3,0 мкм; 2) Zorbax Eclipse XDB-C18 розміром 4,6 х 150 мм, заповнена сорбентом із прищепленою октадецильною фазою зернінням 5,0 мкм.

Для проведення аналізу був встановлений режим роботи:

―  швидкість подачі пересувної фази: 0,20 см3/хв для колонки 1; 1,0 см3/хв для колонки 2;

―  верхня межа робочого тиску елюенту 300 кПа;

―  об'єм проби 5 мкл;

―  режим хроматографування — прокачування елюенту «А» протягом 15 хвилин після введення проби, промивка колонки елюентом «В» протягом 10 хвилин, урівноваження колонки прокачуванням елюенту «А» протягом 10 хвилин;

―  довжина хвилі детектування 210 нм;

―  масштаб реєстрації 1000,0 мАU;

―  час сканування 0,25 сек;

―  температура 25 °С.

ДОДАТОК Б

(довідковий)

Приклади Хроматограм

Рис. 1 Хроматограма суміші органічних кислот. Послідовність елюювання за зростанням часу утримання: винна кислота 2 000 мг/дм3, яблучна кислота 2 000 мг/дм3, молочна кислота 1 000 мг/дм3, лимонна кислота 1 000 мг/дм3 та янтарна кислота 1 000 мг/дм3.

Рис. 2 Хроматограма сухого білого столового вина сорту Шардоне.

ДОДАТОК В

(довідковий)

БІБЛІОГРАФІЯ

1 ТУ 6-09-1709–77 Метанол-яд для хроматографии. Технические условия (Метанол-яд для хроматографії. Технічні умови)

2 ДБН В.2.5–28–2006 Природне і штучне освітлення, затверджені Держбудом України, 2006 р.

3 СНиП 2.04.05–91 Отопление, вентиляция и кондиционирование (Опалення, вентиляція та кондиціонування), затверджені Держкомітетом СРСР з будівництва й інвестицій 28.11.91

4 ДСП 3.3.6.042-99 Державні санітарні норми мікроклімату виробничих приміщень, затверджені МОЗ України 01.12.99 № 42.

_____________________________________________________________

67.160.10; 67.240

Ключові слова: вино, виноматеріали, високоефективна рідинна хроматографія, органічні кислоти (винна, лимонна, молочна, яблучна, янтарна), проведення аналізу.

_____________________________________________________________

Голова ТК 23,

Директор НІВіВ «Магарач» А. Авідзба

Заст. директора НІВіВ «Магарач»

З наукової роботи (виноробство) В. Загоруйко

Керівник розробки:

Зав. відділом хімії та біохімії

НІВіВ «Магарач» В. Гержикова

Відповідальні виконавці:

Пров. науковий співробітник відділу

Хімії та біохімії НІВіВ «Магарач» Н. Анікіна

Пров. хімік відділу

хімії та біохімії НІВіВ «Магарач» Є. Сластя

Зав. лабораторією стандартизації

І метрології НІВіВ «Магарач» О. Дерновá

Ст. науковий співробітник лабораторії

Стандартизації і метрології

НІВіВ «Магарач» В. Бєляєв

Пров. інженер лабораторії

Стандартизації і метрології

НІВіВ «Магарач» Н. Кравченко

Інженер лабораторії

Стандартизації і метрології

НІВіВ «Магарач» І. Гусєва